DNMT1心肌特異性基因敲除SD大鼠模型
討論與結(jié)論
SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003.
生物安全性
SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003.
評價(jià)驗(yàn)證
4.1 心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠模型的建立
利用Cre/loxP重組系統(tǒng)的原理，進(jìn)行條件性敲除（Conditionalknockout，CKO），制備心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠。在DNMT1基因第三外顯子兩端插入兩個loxP位點(diǎn)來構(gòu)建DNMT1flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進(jìn)行雜交，經(jīng)兩輪雜交最終獲得DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，通過PCR方法進(jìn)行基因型鑒定心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠基因型（圖3）。免疫印跡Westernblot方法鑒定DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠DNMT1蛋白的敲除效率達(dá)65.8%（圖4）。
圖3 PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖
圖4 Western blot 檢測Dnmt1蛋白在心肌組織中的敲除效率
4.2 ADR藥物處理后心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠生存率觀察
在正常生理狀態(tài)下，Dnmt1于心肌組織內(nèi)敲除，未見明顯異常。于是我們隨即用阿霉素對大鼠進(jìn)行處理，觀察在面對病理刺激時(shí)，Dnmt1的缺失對心肌病理進(jìn)程是否有影響。結(jié)果，WT-saline組，KO-saline組及KO-ADR組，直至觀察末期未見動物死亡，生存率為100%。而WT-ADR組生存率為75%,（圖5，WT-saline（n = 8）組與WT-ADR（n = 8）相比，P = 0.143）。與WT-ADR組相比，KO-ADR組增加了25%的生存率。Dnmt1敲除可增加經(jīng)ADR藥物處理后的生存率。但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖5 ADR藥物處理后心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠生存率分析
4.3 ADR藥物處理后心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能分析
四組大鼠連續(xù)給予ADR藥物處理2周，給藥終點(diǎn)后觀察2周，觀察終點(diǎn)時(shí)各組大鼠進(jìn)行超聲影像學(xué)觀察。結(jié)果顯示，WT-ADR組大鼠LVIDS（左心室收縮末期內(nèi)徑，Leftventricular end-systolic diameter）增加了23.9%（圖6，n=6，P<0.05）；LVAWS（收縮期左心室前壁厚度，Leftventricular anterior wall; systolic）下降了16.8%（圖6，n=6，P<0.05）；FS%（短軸縮短率，F(xiàn)ractionalshortening）下降了19.3%（圖6，n=6，P<0.05）。
與WT-ADR大鼠相比，KO-ADR大鼠超聲參數(shù)指標(biāo)改善顯著。與KO-saline組大鼠相比，KO-ADR組大鼠LVIDS增加了13.9%（圖6，n=6，P=0.224）；LVAWS下降了14.6%（圖6，n=6，P=0.053）；FS%下降了11.8%（圖6，n=6，P=0.223），但上述3個超聲參數(shù)均無顯著性差異（n=6，P>0.05）。
圖6 ADR藥物處理后大鼠超聲參數(shù)分析
4.4 ADR藥物處理后心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠心肌病理組織學(xué)觀察
Dnmt1敲除可以顯著改善ADR藥物處理后心臟在體形態(tài)和功能，隨后我們進(jìn)一步分析藥物處理后，各組大鼠心肌顯微和超微水平病理組織學(xué)變化情況。
摘取大鼠心臟，稱取心臟濕重，計(jì)算HW/BW比值；制備心臟病理組織切片，H&E及Masson染色觀察大鼠心肌顯微水平病理組織變化；切取大鼠心肌組織，制備電鏡樣本，TEM觀察心肌超微水平組織學(xué)變化。
HW/BW比值結(jié)果顯示，WT-ADR組大鼠，HW/BW增加了14.9%（圖7，n=6，P<0.05）。與KO-saline組大鼠相比，KO-ADR組大鼠HW/BW增加了4.5%（圖7，n=6，P=0.384），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
圖7 ADR藥物處理后各組大鼠HW/BW比值分析
H&E及Masson染色結(jié)果顯示，WT-ADR組大鼠心臟整體增大，心室腔擴(kuò)張，室壁變薄，心肌纖維排列不齊，心肌纖維出現(xiàn)斷裂，心肌纖維化程度顯著增加等現(xiàn)象。與KO-saline組大鼠相比，KO-ADR大鼠心臟整體擴(kuò)張情況明顯改善，心肌纖維斷裂及纖維化程度改善明顯。TEM結(jié)果顯示，WT-saline組大鼠心肌纖維清晰可見，排列有序，心肌線粒體形態(tài)多呈橢圓形，排列整齊有序，雙層膜結(jié)構(gòu)清楚，嵴結(jié)構(gòu)致密。WT-ADR組大鼠，心肌纖維出現(xiàn)明顯斷裂溶解，肌節(jié)出現(xiàn)模糊不清，線粒體發(fā)生嵴斷裂，甚至空化，腫脹明顯（圖8）。與KO-saline組大鼠相比，KO-ADR大鼠心肌纖維斷裂溶解現(xiàn)象改善明顯，線粒體腫脹空化現(xiàn)象亦明顯改善。
圖 8 ADR藥物處理后各組大鼠心肌病理組織學(xué)觀察
制備方法
3.1 實(shí)驗(yàn)材料
3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2012-001】。實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ZLF18003.
3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器
3.1.3實(shí)驗(yàn)試劑
3.1.4模型構(gòu)建流程 利用Cre/loxP重組系統(tǒng)的原理，進(jìn)行條件性敲除（Conditional knockout，CKO），制備心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠。在DNMT1基因第1外顯子兩端插入兩個loxP位點(diǎn)來構(gòu)建DNMT1flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進(jìn)行雜交，經(jīng)兩輪雜交最終獲得DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法進(jìn)行基因型鑒定，使用Western blot技術(shù)進(jìn)行敲除效率的鑒定。 3.1.5 DNMT1條件性敲除大鼠及心肌組織特異性Isca1敲除大鼠的建立 3.1.5.1 DNMT1條件性敲除大鼠模型的建立 (1) 設(shè)計(jì)方案
圖 1. DNMT1條件性敲除模型構(gòu)建設(shè)計(jì)方案
(2) 構(gòu)建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據(jù)基因信息選擇靶點(diǎn)并合成sgRNA。
靶點(diǎn)1:
GCCTCCTGAGCAAGTGCT GGG
R- DNMT1-gRNA UP1 5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT
R- DNMT1-gRNA DOWN1 5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC
靶點(diǎn)2:
AGCCCTGAACTCCTTATG TGG
R- DNMT1-gRNA UP2 5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG
R- DNMT1-gRNA DOWN2 5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT
(3) 合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。
(4) 構(gòu)建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。
(5) 顯微注射
1) 超數(shù)排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進(jìn)行超排。
2) 受精卵注射：取約150枚受精卵進(jìn)行注射。
3) 雄鼠結(jié)扎：制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的SD雄鼠。
4) 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結(jié)扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。
(6) 基因型鑒定
1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進(jìn)行編號及取材。
2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
3) PCR檢測：根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)檢測引物并進(jìn)行PCR檢測。
(7) 結(jié)果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，之后用檢測引物進(jìn)行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
(8) 根據(jù)測序結(jié)果確定Isca1條件性敲除模型大鼠（SD. DNMT1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.1.5.2 心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠（DNMT1flox/flox/MHC-Cre）的建立
根據(jù)3.1.5.1獲得DNMT1flox/+大鼠F1代后，首先通過8周齡左右DNMT1flox/+與野生型大鼠進(jìn)行雜交，獲得一定數(shù)量的DNMT1flox/+大鼠。與此同時(shí)使8周齡左右Isca1flox/+大鼠與αMHC-Cre大鼠（SD.Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）進(jìn)行雜交，得到DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周齡左右DNMT1flox/+大鼠與DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠進(jìn)行第二輪雜交，可得到DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌組織特異性Isca1敲除純合子大鼠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖 2. DNMT1 flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取
在幼崽出生后剪腳趾標(biāo)記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說明書按以下程序操作。
(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
(2) 12000rpm 離心5min，轉(zhuǎn)移上清于一無菌的離心管中。
(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。
(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。
(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。
(6) 重復(fù)步驟（5）一次。
(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。
(8) 重復(fù)步驟（7）一次。
(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。
(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預(yù)熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。
研究背景
一、疾病概述
心力衰竭，簡稱心衰，是指由于心臟收縮和（或）舒張功能障礙，無法將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動脈系統(tǒng)灌注不足，從而引發(fā)心臟循環(huán)障礙癥候群，心衰并不是一個獨(dú)立的疾病，而是所有心血管疾病發(fā)展的終末階段。近年來，隨著我國社會老齡化和高血壓，冠心病等心血管疾病發(fā)病率的增加，使得心衰呈現(xiàn)高發(fā)病率，高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，《2018中國心力衰竭診斷和治療指南》中報(bào)道我國心衰患病率為0.9%，有1000萬左右的心衰患者。
幾乎所有的心血管疾病最終都會導(dǎo)致心衰的發(fā)生，而在基礎(chǔ)性心臟病的基礎(chǔ)上，一些因素亦可誘發(fā)心衰的發(fā)生，常見誘因包括，感染，嚴(yán)重心律失常，心臟負(fù)荷增大，藥物中毒（如洋地黃）等等。
心衰在臨床上可分為急性心衰和慢性心衰。臨床表現(xiàn)，包括呼吸困難，運(yùn)動耐力下降，心室腔增大，心臟功能下降（LVEF<40-50%），心臟順應(yīng)性降低，心室腔內(nèi)淤血，肺循環(huán)及體循環(huán)淤血。
臨床檢查手段，包括超聲影像分析，心電圖，心衰標(biāo)志物（B型利鈉肽（BNP），N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP））心肌壞死標(biāo)志物（心肌肌鈣蛋白T（cTnT）及心肌肌鈣蛋白I（cTnI））。
臨床治療方法，包括強(qiáng)心（米力農(nóng)，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重構(gòu)（卡維地洛）及心臟移植。
二、模型背景
1、實(shí)驗(yàn)動物背景信息
SD大鼠
2、研究背景
心肌細(xì)胞的發(fā)育及病理發(fā)展進(jìn)程是一個協(xié)調(diào)的多步驟過程，在不同階段具有其特征性基因表達(dá)譜，并受多種機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控，如DNA甲基化。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在包括心肌病及心衰在內(nèi)的多種心血管疾病病理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，作為基因組最常見的修飾方式，啟動子區(qū)的甲基化，可導(dǎo)致穩(wěn)定的基因沉默。
關(guān)于DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，其家族各成員的研究較多，但關(guān)于Dnmt1在心臟發(fā)生發(fā)展，特別是在心肌病和心衰病理進(jìn)程中的作用仍不清楚。
我們課題組前期發(fā)現(xiàn)Dnmt1在心肌病動物模型心肌組織中表達(dá)增高，提示我們Dnmt1可能參與心臟發(fā)育及心肌病病理發(fā)展進(jìn)程，所以通過將已建立的Dnmt1條件性敲除工具大鼠與心肌組織特異的Cre過表達(dá)工具大鼠進(jìn)行雜交，從而獲得心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠模型，探究Dnmt1參與心臟發(fā)育及其參與心肌病及心衰病理進(jìn)程的作用及可能的分子機(jī)制，明確Dnmt1的生物學(xué)作用，為心衰等心血管疾病的防治提供思路和研究方向。
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模型信息
中文名稱:DNMT1心肌特異性基因敲除SD大鼠模型
英文名稱:DNMT1 cardiac specific knockout SD rat model
類型:心力衰竭動物模型
分級:NA
用途:用于心力衰竭研究。
研制單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所
保存單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所
