造血干細(xì)胞損傷是長期骨髓抑制的主要誘因，前期的研究顯示造血干細(xì)胞衰老是造血干細(xì)胞損傷的一個重要的機(jī)制，針對于造血干細(xì)胞衰老的研究也有許多突破性的進(jìn)展。前期的研究顯示，4Gy或6Gy全身照射，可以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞衰老 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA ，電離輻射也可以通過激活p53-p21(Cip1/Waf1)通路誘導(dǎo)造血干細(xì)胞衰老，并且可以誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的凋亡。而白消安則主要是通過誘導(dǎo)氧化自由基升高從而引起造血干細(xì)胞早老性改變（premature），并且不引起p53-p21(Cip1/Waf1)通路的表達(dá)變化。因而，白消安誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞損傷模型與電離輻射誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞損傷模型機(jī)制上有所差異，互為補(bǔ)充。

制備動物模型的過程中，使用白消安時操作者應(yīng)該注意帶口罩和手套。

1、白消安降低小鼠外周血計(jì)數(shù) 為探究白消安對小鼠骨髓抑制的影響，我們選取6-8周周齡的C57小鼠15只，體重為18-20g，隨機(jī)分為三組，每組5只，分別為對照組，高劑量白消安組（40mg/kg）和低劑量白消安組（20mg/kg），給藥后15天，檢測小鼠的外周血計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予白消安的小鼠外周血中WBC，PLT的數(shù)目與對照組小鼠相比顯著降低，40mg/kg白消安給藥組比20mg/kg白消安給藥組降低更嚴(yán)重。外周血中的紅細(xì)胞和血紅蛋白數(shù)目各組間無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量白消安和低劑量白消安均引起C57小鼠外周血中白細(xì)胞和血小板數(shù)目降低，損傷造血系統(tǒng)功能。高劑量組損傷程度更嚴(yán)重。

圖1. 白消安對C57小鼠外周血計(jì)數(shù)的影響。C57小鼠接受低劑量和高劑量白消安給藥，15天后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)（A），紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（B），和血紅蛋白計(jì)數(shù)（C），以及血小板計(jì)數(shù)（D）。結(jié)果means ± SE 表示，n=5。

2. 白消安對小鼠骨髓計(jì)數(shù)和體重的影響 觀察給藥對小鼠體重的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，白消安給藥組小鼠的體重未發(fā)現(xiàn)明顯差異。小鼠體態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)弓背和萎靡的癥狀。小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，給藥后15天，給藥組小鼠的骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)與對照組相比，未見明顯變化。提示白消安對骨髓有核細(xì)胞數(shù)目無明顯影響，或者給藥15天后骨髓有核細(xì)胞有所恢復(fù)。

圖2. 白消安對C57小鼠外周血和骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。C57小鼠接受低劑量和高劑量白消安給藥，給藥后不同時間段檢測各組間小鼠體重變化（A），給藥15天后檢測小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)（B）。結(jié)果means ± SE 表示，n=5, *p < 0.05。

3、白消安降低C57小鼠造血干細(xì)胞比例 為探究白消安對C57小鼠造血系統(tǒng)損傷作用，小鼠給藥后15天，用流式細(xì)胞儀檢測小鼠的骨髓細(xì)胞，流式門如圖3所示。我們檢測了造血祖細(xì)胞（lineage-scal-1-ckit+ ，HPC），造血干細(xì)胞細(xì)胞（lineage-scal-1+ckit+，HSC），長期造血干細(xì)胞（lineage-scal-1+ckit+CD34+，LT-HSC）的比例和數(shù)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3.所示，給予低劑量白消安小鼠HPC，HSC，LT-HSC的比例與對照組小鼠相比分別下降20.84%（1.084±0.182 vs 0.858±0.122），47.05%（0.340±0.054% vs 0.180%±0.044%）和49.80%（0.038±0.009vs 0.019±0.008）；給予高劑量白消安小鼠HPC，LSK，HSC的數(shù)目與對照小鼠相比分別下降51.84%（1.084±0.181 vs 0.522±0.132），70.59%（0.340±0.054 vs 0.100±0.001）和69.38%（0.038±0.009 vs 0.011±0.002）（P<0.05）；以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，表明白消安引起造血干細(xì)胞，造血祖細(xì)胞比例和數(shù)目顯著降低，高劑量組與低劑量組相比損傷程度更加明顯。

圖3. 白消安對造血干細(xì)胞比例的的影響。C57小鼠白消安給藥后15天，無菌取骨髓細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測造血細(xì)胞分型。A.流式細(xì)胞儀分析時門的設(shè)置。B.造血祖細(xì)胞（lineage-scal1-ckit+，HPC）比例。C.造血干細(xì)胞（lineage-scal1+ckit+，LSK），細(xì)胞的比例。D.長期造血干細(xì)胞（CD34-lineage-scal1+ckit+，HSC）的比例。結(jié)果用means± SE 表示，n=5。

4、白消安損傷小鼠造血細(xì)胞功能 為了檢測白消安對C57小鼠造血系統(tǒng)功能的影響，分組和給藥方式如上述，白消安給藥后15天，檢測粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成能力。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成能力實(shí)驗(yàn)（colonyforming unit –granulocyte and macrophage， CFU-GM），主要檢測造血祖細(xì)胞分化為特定細(xì)胞群的能力。CFU-GM實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠接受低劑量白消安給藥后，骨髓細(xì)胞的CFU-GM集落形成數(shù)與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（113.3±28.05 vs 142.5±18.64，p>0.05），前期的研究結(jié)果顯示，小鼠骨髓損傷后15天是小鼠損傷恢復(fù)期，雖然HSC和HPC的比例和數(shù)目依然顯著低于對照組（如圖4所示），但是CFU-GM的實(shí)驗(yàn)顯示，造血祖細(xì)胞增殖抑制已經(jīng)有所緩解。小鼠接受高劑量白消安給藥后，骨髓細(xì)胞的CFU-GM集落形成數(shù)較對照組下降65.42%（113.3±28.05 vs 39.17±8.89，p<0.05）。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明40mg/kg白消安可以顯著誘導(dǎo)造血祖細(xì)增殖抑制。

圖4. 白消安誘導(dǎo)C57小鼠造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞增殖抑制。C57小鼠接受高劑量和低劑量白消安給藥，15天后無菌取骨髓細(xì)胞，接種到甲基纖維素培養(yǎng)基（M3534，stemcell），接種后第七天檢測CFU-GM。集落形成數(shù)≥50 個細(xì)胞群落為陽性克隆，統(tǒng)計(jì)105 BMCS中集落形成數(shù)目。流式細(xì)胞儀分選LT-HSC細(xì)胞到培養(yǎng)基中，第14天檢測單細(xì)胞集落形成數(shù)目，結(jié)果用陽性孔在接種孔中比例顯示。A.CFU-GM的數(shù)目。B.單細(xì)胞集落陽性率。結(jié)果用means ± SE 表示，n=5。

單細(xì)胞集落形成能力，利用造血干細(xì)胞接種在特定的培養(yǎng)基里，15天后集落形成能力評價造血干細(xì)胞的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給與低劑量組白消安的小鼠單細(xì)胞集落形成能力與對照組相比降低33.81%（0.62±0.13 vs 0.41±0.23，p>0.05）；而給與高劑量組白消安的小鼠單細(xì)胞集落形成能力與對照組相比降低58.06%（0.62±0.13 vs 0.26±0.15，p<0.05），表明40mg/kg白消安可以明顯降低造血干細(xì)胞功能。

為了進(jìn)一步確定白消安誘導(dǎo)造血干細(xì)胞損傷模型，我們進(jìn)一步檢測了給藥15天和給藥30天后造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠給予40mg/kg白消安，30天后外周血象和HSC和HPC的比例都有所恢復(fù)（結(jié)果未列出），CFU-GM的降低百分比與15天相比有所恢復(fù)（60.71% vs 54.26%），然而單細(xì)胞集落形成能力進(jìn)一步降低（45.16% vs73.80%）。說明隨著時間的延長，白消安對骨髓造血干細(xì)胞的損傷進(jìn)一步加劇。

圖5. 給藥后不同時間檢測白消安對C57小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞集落形成能力的影響。

C57小鼠接受高劑量(40mg/kg)白消安給藥，15天和30天后分別無菌取小鼠骨髓細(xì)胞，接種到甲基纖維素培養(yǎng)基（M3534，stemcell）和干細(xì)胞增殖培養(yǎng)基中，接種后第7天檢測CFU-GM，第14天檢測造血干細(xì)胞單細(xì)胞集落形成能力。CFU-GM結(jié)果為105 BMCS中集落形成數(shù)目。單細(xì)胞集落形成能力以陽性細(xì)胞占接種細(xì)胞比例表示。A.CFU-GM的數(shù)目。B.單細(xì)胞集落陽性率。結(jié)果用means ± SE 表示，n=5。

模型評價方法：1）高劑量組（40mg/kg）和低劑量組（20mg/kg）白消安誘導(dǎo)C57小鼠造血祖細(xì)胞及造血干細(xì)胞損傷；2）小鼠外周血和骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)，造血干細(xì)胞，造血祖細(xì)胞和長期造血干細(xì)胞比例降低；3）小鼠造血祖細(xì)胞增殖能力（CFU-GM）下降；4）造血干細(xì)胞功能（單細(xì)胞集落）下降；造血干細(xì)胞分化和自我更新能力（骨髓移植測定）下降。

1.實(shí)驗(yàn)小鼠 SPF級雄性C57小鼠35只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供［SCXK（京）2014-0004］。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所屏障環(huán)境動物房［SYXK（京）2015-0035］，實(shí)驗(yàn)方案通過醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會（IACUC）審批，IACUC號為：MAM16003。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過福利倫理審查，符合3R原則。

2. 小鼠分組和給藥 白消安（busulfan）購自于sigma。白消安粉末由DMSO配置為80mg/ml作為母液貯存，使用時用PBS稀釋為所需濃度。小鼠分為對照組，低劑量給藥組（20mg/kg）和高劑量給藥組(40mg/kg)，每組5只。腹腔注射，高劑量給藥組分兩天給藥，每天給予20mg/kg。對照組小鼠給予等體積含5%DMSO的PBS作為對照。

3. 造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞比例測定 分離的骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1′ 107/ml，每只小鼠取100ul細(xì)胞用于后續(xù)染色。按體積比1:50加入biotin標(biāo)記的混合一抗抗體CD4，CD8， B220，Ter119，Gr1，CD11b，均購自BD bioscience，4℃條件下孵育30min，PBS洗滌一次，離心條件為1400r/min，5min。離心后棄去上清，保持100ul體積，加入混合抗體Streptavidin（percp標(biāo)記），scal-1（PE標(biāo)記），ckit（APC標(biāo)記），CD34（FITC標(biāo)記），以上抗體均購自BD bioscience。4℃條件下孵育1h。之后PBS洗滌兩次，離心條件如上。BD流式細(xì)胞儀（FACSAriaTMII，BD）檢測造血祖細(xì)胞（Lin-c-kit+ Sca1-or LKS- cells），造血干細(xì)胞（Lin- c-kit+ Sca1+or LKS+ cells），長期造血干細(xì)胞（CD34-Lin-c-kit+Sca1+）在骨髓中所占的比例。

4.骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù) 小鼠分組和給藥方式如上述，白消安給藥后15天小鼠CO2安樂死，75%酒精浸泡消毒，之后在無菌的條件下取小鼠單側(cè)股骨，用含2％FBS的PBS緩沖液沖洗骨髓，將單側(cè)股骨沖洗至2mLEP管中，保持體積為1ml，每只小鼠取10ul用于骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5.粒細(xì)胞集落形成能力測定（colonyforming unit-granulocyte and marchrophage， CFU-GM） CFU-GM實(shí)驗(yàn)通過檢測粒細(xì)胞巨噬系細(xì)胞的集落形成能力，用來檢測造血祖細(xì)胞分化為粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞的能力。無菌取小鼠骨髓細(xì)胞，用PBS將小鼠骨髓濃度調(diào)整至4×105/ml，每個樣加0.2ml細(xì)胞至事先分裝好的2ml M3534培養(yǎng)基中，振蕩器充分混勻，靜置2～5min，待氣泡消失。加入24 孔板，每孔0.5ml。輕搖培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基均勻分布。將培養(yǎng)板放入濕盒，置入37oC，5％CO2 培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第7天在倒置顯微鏡下觀察。低倍觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)≥50 為陽性集落。

6.外周血計(jì)數(shù) 用抗凝管收集外周血。自動血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（ABX pentra DX 120，法國）測定外周血中白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指標(biāo)。

7.單細(xì)胞集落能力檢測 本方法依據(jù)前期發(fā)表文章 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA [8, 9]，分離的骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1′ 107/ml，每只小鼠取100ul細(xì)胞用于后續(xù)染色。按體積比1:50加入biotin標(biāo)記的混合一抗抗體CD4, CD8, B220，Ter119，Gr1，cd11b，4℃條件下孵育30min，PBS洗滌一次，離心條件為1400r/min，4℃，5min。離心后棄去上清，保持100ul體積，加入混合抗體Streptavidin（percp標(biāo)記），scal-1（PE標(biāo)記），ckit（APC標(biāo)記），CD34（FITC標(biāo)記）。4℃條件下孵育1h。之后PBS洗滌兩次，離心條件如上。BD流式細(xì)胞儀（FACS AriaTMII，BD）分選長期造血干細(xì)胞（CD34-Lin-c-kit+Sca1+）到提前加了100ul甲基纖維素培養(yǎng)基（Gibco MAM HS001）的96孔板中。每個孔兩個細(xì)胞，待接種分選造血干細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)15天，低倍觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)≥50 為陽性集落，結(jié)果計(jì)算每組陽性孔比例。

8. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差誤（mean±SEM）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way AVOVA）和Tukey 多重比較法（Tukey's Multiple Comparison Test），重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析方法。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

一、疾病概述

骨髓抑制是指骨髓中的幼稚造血細(xì)胞活性下降。外周血的紅細(xì)胞和白細(xì)胞都源于骨髓中的造血干細(xì)胞。外周血血細(xì)胞壽命短，常常需要不斷補(bǔ)充。為了達(dá)到及時補(bǔ)充的目的，需要造血干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞必須快速分裂?；瘜W(xué)治療（chemotherapy）和放射治療（radiotherapy）以及許多其它抗腫瘤治療方法，都是針對快速分裂的細(xì)胞，因而常常導(dǎo)致正常骨髓抑制。

1.病因 骨髓抑制是多數(shù)化療藥的常見毒性反應(yīng)，是化療終止的常見限制性因素。血細(xì)胞由多種成分組成,每一種成分都對人體起著不可缺少的作用,任何一種成分的減少都使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的副反應(yīng)。

白消安（Busulfan），商品名馬利蘭，1,4-丁二醇二甲烷磺酸鹽，屬甲烷磺酸酯類烷化劑抗惡性腫瘤藥，在體內(nèi)解離后起烷化作用，主要通過與DNA形成交叉聯(lián)結(jié)而破壞DNA結(jié)構(gòu)。白消安口服易吸收，可口服給藥，組織分布迅速，t1/2約為2-3h；絕大部分與谷胱甘肽結(jié)合，通過肝內(nèi)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化并代謝呈甲烷磺酸由尿排出 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 。

小劑量白消安即可明顯抑制粒細(xì)胞生成，對慢性粒細(xì)胞性白血病（Chronic Myelocytic Leukemia, CML）療效顯著，對慢性粒細(xì)胞白血病急性病變無效，由于不良反應(yīng)即骨髓抑制較嚴(yán)重，逐漸被伊馬替尼（Imatinib）替代，目前僅用于骨髓移植。白消安能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，主要副作用是造血干細(xì)胞功能受損，當(dāng)劑量較高時也會損傷造血祖細(xì)胞功能。白消安還可能通過誘導(dǎo)HSC衰老損傷骨髓造血系統(tǒng)功能。與白消安藥物作用機(jī)制相似的有：烷化劑-氮芥、環(huán)磷酰胺；鉑類配合物-順鉑；抗腫瘤抗生素-絲裂霉素等等。白消安常用來構(gòu)建再生障礙性貧血動物模型和男性無精子癥動物模型。

2.臨床表現(xiàn) 骨髓抑制是腫瘤化療藥物的主要劑量限制性毒性之一，除激素類、博來霉素和L-門冬酰胺酶外，大多數(shù)抗腫瘤藥物均會導(dǎo)致不同程度的骨髓抑制。經(jīng)化療后通常先出現(xiàn)白細(xì)胞減少，然后出現(xiàn)血小板降低，嚴(yán)重情況下會出現(xiàn)貧血。

3. 骨髓抑制的級別診斷 骨髓的抑制程度根據(jù)WHO分為0～Ⅳ級：

表1. 骨髓的抑制程度分級

骨髓抑制通常發(fā)生在化療后。因粒細(xì)胞平均生存時間最短，約為6-8小時，因此骨髓抑制常最先表現(xiàn)為白細(xì)胞下降;血小板平均生存時間約為5-7天，其下降出現(xiàn)較晚較輕;而紅細(xì)胞平均生存時間為120天，受化療影響較小，下降通常不明顯。多數(shù)化療藥物所致的骨髓抑制，通常見于化療后1-3周，約持續(xù)2-4周逐漸恢復(fù)，并以白細(xì)胞下降為主，可有伴血小板下降，少數(shù)藥如健擇、卡鉑、絲裂霉素等則以血小板下降為主。所以在化療后可檢測白細(xì)胞和血小板的數(shù)量來判斷是否發(fā)生了骨髓抑制。

3.臨床治療 化療后出現(xiàn)骨髓抑制常用各種集落刺激因子如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor, GM-CSF）、粒細(xì)胞集落刺激因子（GranulocyteColony Stimulating Factor, G-CSF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（MacrophageColony Stimulating Factor, M-CSF）、促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin,EPO）等來處理血象降低，護(hù)理中必須采取措施預(yù)防各種感染和防治出血等。

二、模型背景

1、實(shí)驗(yàn)動物背景信息

C57BL/6J小鼠。

2、研究背景

由于骨髓抑制是腫瘤化療藥物的主要劑量限制性毒性之一。歷來是臨床和基礎(chǔ)研究極為關(guān)注的內(nèi)容。具有細(xì)胞毒性的化療藥物，低劑量主要損傷骨髓造血祖細(xì)胞（HPC），在臨床上癥狀比較明顯，目前主要應(yīng)用一些生長因子進(jìn)行恢復(fù)治療。當(dāng)化療藥物劑量大或者一些敏感的患者會出現(xiàn)造血干細(xì)胞（HSC）損傷，逐漸出現(xiàn)全血減少，在臨床上起病比較隱匿，容易被忽視。一旦發(fā)生，缺乏有效的治療方法，預(yù)后較差。因此化療導(dǎo)致骨髓損傷防治的研究歷史也比較長。比較常用的是環(huán)磷酰胺（CTX），環(huán)磷酰胺主要對淋巴細(xì)胞殺傷作用比較強(qiáng)，在大劑量下才可以引起造血干祖細(xì)胞損傷。白消安則對造血干細(xì)胞的毒性較大。利用白消安制備的骨髓抑制模型對研究化療導(dǎo)致的造血干細(xì)胞損傷機(jī)制研究具有一定的優(yōu)勢。

小鼠尤其C57小鼠在研究造血系統(tǒng)的生理及病理調(diào)節(jié)方面應(yīng)用最為廣泛。另外大動物包括犬、猴等都有造模用于造血系統(tǒng)化療藥損傷的預(yù)防與治療。