該模型的主要評價指標(biāo)為不同感染期的肺脾肝荷菌量和病變評分值，該模型與國內(nèi)外報道的經(jīng)典cornell模型類似，但是cronell模型的問題在于模型潛伏期荷菌量過高，復(fù)發(fā)期3-9個月后不等。本模型不斷的摸索嘗試克服以上問題，模型均一，參數(shù)指標(biāo)穩(wěn)定，各感染期的荷菌量值水平合適（不過低也不過高），周期明顯縮短，由3-9個月不等的周期縮短到比較穩(wěn)定的10周，便于應(yīng)用。

該模型不僅可以用于潛伏及復(fù)發(fā)的早期診斷分子的研究，還可以利用潛伏及復(fù)發(fā)期研究疾病機(jī)制，同時可以用于評價潛伏感染的預(yù)防性抗生素效果，以及治療性疫苗的效果。

動物模型的制備的設(shè)計得到研究所IACUC委員會的批準(zhǔn)，人員都是訓(xùn)練有素的研究人員和實驗人員，全程在ABSL-3實驗室中進(jìn)行，完全按照模型制備和檢測的一系列SOP操作進(jìn)行，遵守生物安全操作要求，無安全事故。

1. 荷菌量檢測結(jié)果

結(jié)核活動性感染的第二周，采用異煙肼治療4周，4周后進(jìn)入潛伏期，肺脾肝荷菌量為0，治療后自然復(fù)發(fā)及誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后肺脾肝荷菌量明顯升高，其中誘導(dǎo)后復(fù)發(fā)水平更高，以活動期的同期肺荷菌量為對照（control）。在感染不同階段檢測肺脾肝組織的荷菌量值與個感染期的菌復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)吻合。其中肺組織荷菌量為判斷的主要標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如下：

圖2 潛伏期和再發(fā)期肺組織的荷菌量

左圖：肺組織的潛伏期荷菌量的對數(shù)，右圖是復(fù)發(fā)期各組的肺組織荷菌量。**P<0.01,***P<0.001

2. 病理病變結(jié)果

結(jié)核活動性感染的第二周，采用異煙肼治療4周，4周后進(jìn)入潛伏期，肺脾肝病理病變明顯減輕，治療后自然復(fù)發(fā)及誘導(dǎo)復(fù)發(fā)后肺脾肝病變加重，其中誘導(dǎo)后復(fù)發(fā)水平更明顯，以活動期的同期肺病變?yōu)閷φ眨╟ontrol）。在感染不同階段檢測肺脾肝組織病變評分與個感染期的菌復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)吻合。其中肺組織病變?yōu)榕袛嗟闹饕獦?biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如下：

圖3 潛伏期和再發(fā)期肺組織的病變評分

左圖：肺組織的潛伏期肺病變評分，右圖是復(fù)發(fā)期各組的肺病變評分。**P<0.01,***P<0.001

3. 模型的評價

本模型采用的評價主要采取以整體表觀效度的評價方法，核心指標(biāo)是每個感染期的組織病變和荷菌量，根據(jù)結(jié)核病的不同感染期標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)來評估。比如小鼠感染后前兩周，表現(xiàn)為活動性結(jié)核模型，肺脾肝組織有明顯的病變，荷菌量達(dá)到104CFU以上，用抗結(jié)核藥物治療一個月后，與臨床上治療對應(yīng)，小鼠中活動性結(jié)核菌被殺滅，剩余的菌潛伏在肺脾肝組織中，表現(xiàn)為組織荷菌量呈極低水平，有些小鼠的荷菌量可為0值，與此同時，肺脾肝組織的病變減輕，表現(xiàn)為輕微炎癥或無明顯病變，綜合組織荷菌量和病變指標(biāo)，可以判斷此階段較好的模擬臨床上潛伏感染狀態(tài)。值得注意的是，該階段與治愈的區(qū)別在于，潛伏后小鼠可以自然或通過誘導(dǎo)劑引起肺脾肝組織中結(jié)核菌復(fù)燃，結(jié)核再活動，表現(xiàn)為荷菌量反彈升高，呈現(xiàn)明顯的病變。

4.模型的驗證

通過設(shè)置無治療的感染對照組，以及無誘導(dǎo)劑的對照組，可以判斷，治療后小鼠處于潛伏期，誘導(dǎo)后潛伏的結(jié)核菌可導(dǎo)致結(jié)核的再發(fā)。

另外的實驗，通過設(shè)置不同的治療方案，比如單用抗結(jié)核化療藥異煙肼，以及異煙肼搭配免疫制劑PD-L1抗體，與對照組比較，綜合判斷復(fù)發(fā)期的起始時間點、荷菌量水平、病變程度，來確定治療效果。

本模型已至少通過3個批次的實驗來重復(fù)驗證，參數(shù)指標(biāo)穩(wěn)定。

（一）實驗材料

1. 試劑

1）LEAFTM Purified Anti-Mouse TNF-α(Biolegend，美國)

2）Isoniazid(Sigma，美國)

3）蘇木精-伊紅染料（HE染料）

5）0.01M PBS等

6）FBS（Life TechnologiesCorporation，USA）

8）4%多聚甲醛

9）75%醫(yī)用消毒酒精（北京貞玉民生藥業(yè)有限公司）

10）分支桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)管中性羅氏培養(yǎng)管（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，中國）

11）Trizol（Invitrogen）

12）二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）

13）一次性無菌培養(yǎng)皿（康寧 ）

14）眼科剪（經(jīng)高壓滅菌）15）眼科鑷（經(jīng)高壓滅菌）16）EP管（1.5mL）（Axygen）

17）胰島素注射器（BD,美國）

18）1mL注射器（雙鴿，中國）

19）組織研磨器（美天旎，德國）

2. 儀器設(shè)備

1）數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)

2）NanoZoomerS60明場熒光切片掃描儀（日本）

3）溫控水浴鍋(北京市六一儀器廠)

4）超低溫冰箱(三洋，日本)

5）低溫高速離心機(jī)(BECKMAN，美國)

6）臺式離心機(jī)(上海安亭離心機(jī)廠)

7）可調(diào)微量1ml, 200ul, 100 ul, 20ul, 10 ul移液器(Gilson公司)

8）Ⅱ級生物安全柜（哈爾濱東聯(lián)哈爾）

9）渦旋振蕩器（QILINBEIER,QL-861）

10）960 Bacteria MGIT系統(tǒng)（BD，美國）

11）細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀（廣東體必康生物科技有限公司，中國）

12）高速低溫離心機(jī)（Thermo Scientific）

13) 組織研磨器（美天旎，德國）

14）電子天平（Ohaus Corp·PineBrook，USA）

15）組織脫水機(jī)（Leica）

16）石蠟包埋機(jī)（Leica）

17）石蠟切片機(jī)

18）電磁爐

（二) 實驗設(shè)計

（三）動物感染和取材 固定小鼠于小鼠固定器中，暴露小鼠鼠尾，用75%酒精棉球擦拭鼠尾以暴露尾靜脈， 以1.0×107CFU/mL的 H37Rv 200uL/只尾靜脈感染C57BL/6小鼠，兩周之后給予異煙肼（10mg/kg）連續(xù)治療四周，之后TNF-α抗體（50ug/只/周）誘導(dǎo)四周。每個時間點各組分別取4只小鼠脫頸椎處死，解剖取脾臟、肺臟、肝臟組織進(jìn)行荷菌量的檢測和病理分析，所有的實驗均在生物安全3級實驗室（ABSL-3）進(jìn)行操作。

（四）組織荷菌量檢測 （1）生物安全柜中，用眼科鑷取左側(cè)肺組織、脾頭1/3及肝靠腹背部的小葉部分用于組織研磨。 （2）組織依次用生理鹽水、4%硫酸和生理鹽水漂洗，加1mL生理鹽水到研磨器中研磨，各組織研磨的勻漿液分別取100μL，用生理鹽水按照1：10的比例進(jìn)行梯度稀釋5個濃度梯度，分別是10-1，10-2，10-3，10-4，10-5。 （3）取合適的三個稀釋度的組織稀釋液50或100μL，接種在分支桿菌中性羅氏培養(yǎng)管中，使組織研磨液能夠充分的被固體培養(yǎng)基吸收，每個梯度各接種3管。 （4）將接種好的組織培養(yǎng)基的羅氏固體培養(yǎng)基置于斜面上，之后置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4周進(jìn)行菌落計數(shù)。 （五） 組織病理分析 余下的脾、肺、肝組織置于4%中性甲醛固定液中固定一周后，脾臟和肝臟組織分別按長軸最大橫切面進(jìn)行修塊，肺組織完整分離小肺葉。 按照常規(guī)石蠟切片制作方法包埋、修塊、制片，HE染色后分析組織病理病變，HE片用NanoZoomer S60明場熒光切片掃描儀進(jìn)行明場半自動掃片，掃完的HE片子用專用固態(tài)硬盤拷出，用VDP.View 2軟件對病變組織進(jìn)行定量分析。 病理診斷和分析由至少兩名病理資深診斷專家采取雙盲方法讀片和給出報告。分析單位面積（mm2)的肺組織中肉芽腫面積，單位面積（mm2)脾臟內(nèi)白髓內(nèi)肉芽腫的面積，單位面積（mm2)肝臟內(nèi)肉芽腫個數(shù)。 （六）數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(`x±s ) 表示。采用統(tǒng)計軟件Graphpad prism 7進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果采用單因素方差分析( One-way ANOVA)，t檢驗和Tukey 檢驗分析組間差異是否顯著，P <0.05認(rèn)為差異有顯著性。

一、疾病概述

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌感染后所致的疾病，結(jié)核分支桿菌感染后約90%以上的人群不發(fā)病，呈隱性感染，即潛伏感染，約10%的人群感染后形成活動性結(jié)核病，多見肺結(jié)核，少量人群出現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎、腸結(jié)核、骨結(jié)核、淋巴結(jié)核和眼結(jié)核等。

肺結(jié)核的臨床表現(xiàn)較為明顯，有咳嗽咳痰，午后低熱盜汗，嚴(yán)重者有咯血等表現(xiàn)，通過結(jié)核菌素的皮試陽性，痰菌培養(yǎng)陽性以及胸片學(xué)變化可以診斷肺結(jié)核。對于一部分痰培養(yǎng)陰性的結(jié)核患者，綜合臨床變現(xiàn)、皮試、胸片結(jié)果及其他血液學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)輔助診斷，特殊情況下可以進(jìn)行治療性診斷。

Dannenberg等將結(jié)核菌感染和發(fā)病的生物學(xué)過程可分為起始期、T細(xì)胞反應(yīng)期、共生期和細(xì)胞外繁殖傳播期。侵入呼吸道的結(jié)核菌被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬。細(xì)菌在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制，便擴(kuò)散至鄰近非活化的肺泡巨噬細(xì)胞和形成早期感染灶。否則若被殺滅，則不留任何局部證據(jù)。在T細(xì)胞反應(yīng)期，結(jié)核菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的最初生長，形成中心呈固態(tài)干酪壞死的結(jié)核灶，它能限制結(jié)核菌繼續(xù)復(fù)制。由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫（cell?mediatedimmunity，CMI）和遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（delaytype hyperensitivity，DTH）在此形成，從而對結(jié)核病發(fā)病、演變及轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生決定性影響。大多數(shù)感染者發(fā)展至T細(xì)胞反應(yīng)期，僅少數(shù)發(fā)生原發(fā)性結(jié)核病。大部分感染者結(jié)核菌可以持續(xù)存活，細(xì)菌與宿主處于共生狀態(tài)。纖維包裹的壞死灶干酪性中央部位被認(rèn)為是持續(xù)存在的主要場所。低氧、低pH和抑制性脂肪酸的存在使細(xì)菌不能增殖。宿主的免疫機(jī)制亦是抑制細(xì)菌增殖的重要因素，免疫損害便可引起受抑制結(jié)核菌的重新活動和增殖，大量結(jié)核菌從液化干酪灶釋放形成播散。

活動性結(jié)核通過標(biāo)準(zhǔn)的短程化療可以治愈，然而由于治療期較長，有些病人并不能很好的堅持全程化療，在治療一個月后，結(jié)核的癥狀基本消失，但是機(jī)體中依然潛伏有少量結(jié)核菌，機(jī)體免疫正常時，可以在較長時間內(nèi)都不出現(xiàn)癥狀發(fā)病，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時，潛伏在體內(nèi)的結(jié)核菌大量復(fù)制增殖，表現(xiàn)為結(jié)核病的再活動。

二、模型背景

1、結(jié)核菌菌株信息

本模型所用的病原菌為結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，是國際公認(rèn)的模型用菌株，該菌株為單細(xì)胞克隆，基因序列已知，對抗結(jié)核藥物敏感。

2、實驗動物背景信息

本模型所用的實驗動物為C57BL/6小鼠，SPF級，4-6周齡的雌性小鼠。C57小鼠對結(jié)核菌比較敏感，并且該品系小鼠是很多基因工程小鼠的背景小鼠，便于進(jìn)行結(jié)核病的機(jī)制研究。此外，小鼠作為實驗動物，相應(yīng)的免疫試劑比較齊全，而且動物成本相對較低，飼養(yǎng)的空間要求較其它實驗動物低，易于開展實驗。

3、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。

治療后潛伏感染及再發(fā)的模型，主要模擬臨床上活動性結(jié)核病人治療后，癥狀消失，但是未徹底清除體內(nèi)潛伏結(jié)核菌，當(dāng)機(jī)體免疫力降低時，潛伏的結(jié)核菌復(fù)燃，結(jié)核病再活動的病人。該模型，不僅可用于潛伏感染的疫苗評價，潛伏期預(yù)防性治療的藥物和方案評價，還可以通過比較不同感染期，研究潛伏感染的早期診斷分子，疾病再發(fā)的機(jī)制。

目前，國內(nèi)外報道的治療后潛伏及再發(fā)的小鼠模型，即Cornell模型，該模型周期較長，潛伏期的組織菌量較高，可達(dá)到103以上的數(shù)量級，不能很好的模擬人群中潛伏的狀態(tài)，此外，潛伏期后再發(fā)的時間和水平存在組內(nèi)個體差異大的問題，因此，已有的模型需要優(yōu)化，以便更能模擬潛伏和再發(fā)的狀態(tài)，同時盡量使模型的組內(nèi)均一性提高，縮短模型的周期，便于實際應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 呂艷,劉文文,王聰,趙微,王濤,白麗.結(jié)核分支桿菌H37Ra感染小鼠模型建立及其對B細(xì)胞發(fā)育分化特征的實驗研究[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2019,20(01):58-62.

[2] deSteenwinkel JE, de Knegt GJ, ten Kate MT, et al. Relapse of tuberculosis versusprimary tuberculosis; course, pathogenesis and therapy in mice[J]. Tuberculosis(Edinb), 2013, 93(2): 213-21.

[3] Ma J, TengX, Wang X, et al. A Multistage Subunit Vaccine Effectively Protects MiceAgainst Primary Progressive Tuberculosis, Latency and Reactivation[J].EBioMedicine, 2017, 22: 143-154.

[4]占玲俊,盧錦標(biāo),唐軍,陳保文,秦川.耐藥結(jié)核分支桿菌潛伏-復(fù)發(fā)感染動物模型的研究進(jìn)展[J].微生物與感染,2016,11(01):59-64.

[5]師長宏.結(jié)核桿菌潛伏感染小鼠模型的制備及其評價指標(biāo)[J].中國實驗動物學(xué)報,2010,18(06):538-541.

[6]林樹柱,董娜,向志光,徐艷峰,占玲俊,馬春梅,秦川.結(jié)核分支桿菌低劑量感染小鼠模型的建立與分析[J].中國防癆雜志,2012,34(12):817-820。