Crtc1，一種調(diào)節(jié)CREB活性的轉(zhuǎn)錄輔助因子，已參與代謝綜合征的發(fā)病機(jī)理。但是，Crtc1對(duì)脂肪組織代謝的影響及其潛在機(jī)制尚不清楚。我們首先發(fā)現(xiàn)Crtc1-/-小鼠的體重和脂肪重量（包括sWAT，eWAT和BAT）顯著增加，血漿進(jìn)行了生化分析，發(fā)現(xiàn)與Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠出現(xiàn)了高血糖癥。

我們發(fā)現(xiàn)缺乏Crtc1嚴(yán)重?fù)p害了小鼠的生殖能力。Crtc1缺失對(duì)肝臟的脂代謝無(wú)顯著影響。然而，通過H＆E染色證實(shí)，Crtc1-/-小鼠的脂肪細(xì)胞的面積有顯著增加的趨勢(shì)。總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)，Crtc1-/-缺乏引起脂肪堆積可能與PPARγ信號(hào)通路的激活有關(guān)；表明CRTC1可能成為治療肥胖的一個(gè)潛在分子靶點(diǎn)。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級(jí)過濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

dsDNA升高，皮膚破損，皮膚炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

血清學(xué)檢測(cè)抗dsDNA和抗ANA抗體，表型觀察皮膚破損情況，病理觀察淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.項(xiàng)目策略圖

此模型采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Crtc1基因進(jìn)行基因編輯，原理示意圖如下：

2.項(xiàng)目策略概述

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時(shí)注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導(dǎo)下結(jié)合到靶位點(diǎn)進(jìn)而造成DNA雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)堿基序列缺失，實(shí)現(xiàn)基因敲除。

3.gRNA序列信息

gRNA1:GCTGACATCTGTGAATTGTA (5’ – 3’), PAM: GGG.

gRNA2:CTGCATGCTGGATCGACAGG (5’ – 3’), PAM: TGG.

4. 正常喂養(yǎng)條件下，檢測(cè)8個(gè)月大的Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的體重，心臟，肝臟，體重，eWAT，sWAT，和BAT的重量。

5. 正常喂養(yǎng)條件下，檢測(cè)8個(gè)月大時(shí)Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的甘油三酸酯，總膽固醇，F(xiàn)ABP4含量。通過油紅O或H＆E染色，檢測(cè)肝和eWAT的脂肪細(xì)胞面積，并進(jìn)行量化。

圖1. 構(gòu)建Crtc1敲除鼠。（A）使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除Crtc1基因示意圖。（B）通過PCR鑒定Crtc1敲除鼠。（C）Western blotting檢測(cè)Crtc1的蛋白質(zhì)水平。2.2 Crtc1敲除小鼠不育 我們發(fā)現(xiàn)Crtc1的全身缺乏會(huì)導(dǎo)致生育能力嚴(yán)重受損。在Crtc1-/-雄性和Crtc1-/-雌性小鼠的三個(gè)交配籠子中，只有一只小鼠出生，并立即死亡。但是，雜合的Crtc1 +/-小鼠具有正常的生育能力，并以預(yù)期的孟德爾頻率出生（表1）。表1雜合Crtc1+/-小鼠交配后代小鼠信息

2.3 Crtc1敲除小鼠會(huì)造成自發(fā)肥胖 在正常喂養(yǎng)條件下，與8個(gè)月大的Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠顯示出明顯更大的體型和較重的體重（圖2A）。顯然，體重增加的原因主要包括eWAT，sWAT和BAT脂肪重量增加（圖2E-G）。這些數(shù)據(jù)表明在發(fā)育過程中Crtc1-/-小鼠自發(fā)地發(fā)展為肥胖。

圖2. Crtc1-/-小鼠自發(fā)地發(fā)展為肥胖結(jié)果。（A）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的代表性圖像和體重；（B）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠進(jìn)食量的觀察；（C）Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠進(jìn)食量的柱狀圖展示；（D）Crtc1缺失對(duì)不同器官重量的影響，包括肝臟, eWAT，sWAT和BAT。數(shù)據(jù)為平均值±SEM。* P <0.05；** P <0.01，*** P <0.001，n.s. 表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

CRTC1缺失加速脂肪細(xì)胞中脂肪的積累

盡管兩組之間的血漿TC和TG沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是Crtc1-/-小鼠血漿FABP4的水平較高，F(xiàn)ABP4是主要由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子（圖3A-C）。 此外，與Crtc1 + / +小鼠相比，Crtc1-/-小鼠的空腹血糖（FBG）水平顯著升高（圖3D）。 肝臟和脂肪是控制脂質(zhì)代謝的主要組織。 H＆E和油紅O染色顯示Crtc1缺乏對(duì)肝臟形態(tài)和脂質(zhì)滴的形成沒有顯著影響（圖3E）。 但是，我們發(fā)現(xiàn)與Crtc1 + / +小鼠相比，來自Crtc1-/- eWAT的脂肪細(xì)胞平均面積顯著增加（圖3G）。 這些數(shù)據(jù)表明，Crtc1缺失后脂肪積累的增加可能歸因于脂肪細(xì)胞的分化和成熟。

圖3. Crtc1-/-小鼠脂質(zhì)代謝異常相關(guān)結(jié)果。（A-C）8個(gè)月大時(shí)Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的甘油三酸酯（A），總膽固醇（B），F(xiàn)ABP4含量（C）的循環(huán)水平。（D）來自Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的肝組織的油紅O或H＆E染色。（E）肝臟油紅色陽(yáng)性區(qū)域的定量。（F）來自Crtc1+/+和Crtc1-/-小鼠的eWAT的H＆E染色。（G）eWAT中脂肪細(xì)胞面積的量化。數(shù)據(jù)為平均值±SEM。* P <0.05；*** P <0.001和n.s. 表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TG，甘油三酸酯。TCh，總膽固醇。

一、疾病概述 肥胖，與多種高危疾病相關(guān)，包括胰島素抵抗，血脂異常，高血壓，心血管疾病和癌癥。在肥胖的發(fā)展過程中，白色脂肪組織（WAT）中脂肪細(xì)胞的體積增大和/或脂肪細(xì)胞數(shù)量增多，導(dǎo)致WAT感知營(yíng)養(yǎng)的能力受損，并進(jìn)一步導(dǎo)致異位脂質(zhì)沉積。在功能上，皮下白色脂肪組織（sWAT）具有比附睪白色脂肪組織（eWAT）有更大的成脂分化能力。然而，當(dāng)sWAT無(wú)法容納過多的脂肪沉積時(shí)，eWAT中的脂肪積累在一定程度上反映了代謝風(fēng)險(xiǎn)。多種因素與脂肪堆積相關(guān)，包括年齡，性別，性激素，遺傳學(xué)，種族，生活方式等。因此，如何有效的減少脂肪堆積是該領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)之一。二、模型背景1、Crtc1基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號(hào)）：382056? 敲除基因NCBI網(wǎng)址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ 382056? 敲除基因名稱（MGI號(hào)）：Crtc1（MGI: 2142523）? 敲除基因Ensembl網(wǎng)址鏈接：http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000003575;r=8:70382355-70439579? 方案針對(duì)的轉(zhuǎn)錄本（Ensembl號(hào)）：ENSMUST00000076615.5? 方案敲除的exon：exon2-exon42、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個(gè)亞系。1985年從Olac引到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。毛色：黑色。 主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無(wú)眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對(duì)放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對(duì)結(jié)核桿菌敏感。對(duì)鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質(zhì)濃度低。對(duì)百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。 主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 Crtc1, CREB調(diào)控轉(zhuǎn)錄共激活因子1，系CREB轉(zhuǎn)錄輔因子家族的成員之一，在存在cAMP刺激的情況下，可作為調(diào)節(jié)CREB活性的傳感器[1, 2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Crtc1缺失對(duì)小鼠生殖能力有顯著影響，還參與了晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)[3]，外周葡萄糖代謝[4]，心臟功能[5]，記憶形成[6]，抑郁癥[7]等生理、病理進(jìn)程。肥胖，與多種高危疾病相關(guān)，包括胰島素抵抗，血脂異常，高血壓，心血管疾病和癌癥。許多病因包括年齡，性別，性激素，遺傳學(xué)，種族，生活方式等，都有助于脂肪積累[8, 9]。如何有效的減少脂肪堆積仍是該領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)Crtc1-/-小鼠會(huì)發(fā)生自發(fā)的肥胖，且目前并無(wú)相關(guān)研究探究Crtc1在脂肪組織中的作用，因此，我們首先探究Crtc1對(duì)脂肪組織代謝的影響和潛在分子機(jī)制的研究。另有相關(guān)研究表明，Crtc1與呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病也有關(guān)系。有研究[10]發(fā)現(xiàn)LKB1通過促進(jìn)CRTC1從細(xì)胞核的胞質(zhì)易位而負(fù)調(diào)控NEDD9轉(zhuǎn)錄，部分逆轉(zhuǎn)了LKB1對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。該研究結(jié)果為解釋LKB1缺乏促進(jìn)肺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移提供了潛在的分子機(jī)制與治療靶點(diǎn)。另有研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，在肺粘液表皮樣癌（MEC）在很多情況下，伴隨著新型融合癌基因（CRTC1-MAML2）的復(fù)發(fā)性t（11; 19）易位，CRTC1-MAML2癌基因充當(dāng)Notch和CREB調(diào)節(jié)途徑的轉(zhuǎn)錄因子，破壞正常的細(xì)胞周期和分化，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。CRTC1-MAML2不僅可以作為判斷腫瘤是否發(fā)生的標(biāo)志物，也顯著影響腫瘤患者的預(yù)后狀況和抗腫瘤藥物的治療效果。有研究通過microRNA 組學(xué)分析，卵白蛋白（OVA）誘導(dǎo)的過敏性氣道炎癥（AAI）小鼠的肺組織中miRNA的改變，鑒定出miR-17，miR-144和miR-21可能發(fā)揮重要作用，通過計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析出轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（Creb1）及其轉(zhuǎn)錄共激活因子（Crtc1-3）可能作為其潛在靶點(diǎn)，有望成為治療哮喘疾病的靶點(diǎn)[14]。參考文獻(xiàn)：1. Altarejos, J.Y., et al., The Creb1 coactivator Crtc1 is required for energy balance and fertility. Nat Med, 2008. 14(10): p. 1112-7.2. Iourgenko, V., et al., Identification of a family of cAMP response element-binding protein coactivators by genome-scale functional analysis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(21): p. 12147-52.3. Jagannath, A., et al., The CRTC1-SIK1 pathway regulates entrainment of the circadian clock. Cell, 2013. 154(5): p. 1100-1111.4. Kim, G.H., et al., Leptin recruits Creb-regulated transcriptional coactivator 1 to improve hyperglycemia in insulin-deficient diabetes. Mol Metab, 2015. 4(3): p. 227-36.5. Morhenn, K., et al., Mechanistic role of the CREB-regulated transcription coactivator 1 in cardiac hypertrophy. J Mol Cell Cardiol, 2019. 127: p. 31-43.6. Uchida, S., et al., CRTC1 Nuclear Translocation Following Learning Modulates Memory Strength via Exchange of Chromatin Remodeling Complexes on the Fgf1 Gene. Cell Rep, 2017. 18(2): p. 352-366.7. Wang, Y.J., et al., Imipramine exerts antidepressant-like effects in chronic stress models of depression by promoting CRTC1 expression in the mPFC. Brain Res Bull, 2020. 164: p. 257-268.8. Emerging Risk Factors, C., et al., Separate and combined associations of body-mass index and abdominal adiposity with cardiovascular disease: collaborative analysis of 58 prospective studies. Lancet, 2011. 377(9771): p. 1085-95.9. Malden, S., et al., Obesity in young children and its relationship with diagnosis of asthma, vitamin D deficiency, iron deficiency, specific allergies and flat-footedness: A systematic review and meta-analysis. Obes Rev, 2020.10. Feng, Y., et al., The CRTC1-NEDD9 signaling axis mediates lung cancer progression caused by LKB1 loss. Cancer Res, 2012. 72(24): p. 6502-11.11. Von Holstein, S.L., et al., CRTC1-MAML2 gene fusion in mucoepidermoid carcinoma of the lacrimal gland. Oncol Rep, 2012. 27(5): p. 1413-6.12. O'Neill, I.D., Gefitinib as targeted therapy for mucoepidermoid carcinoma of the lung: possible significance of CRTC1-MAML2 oncogene. Lung Cancer, 2009. 64(1): p. 129-30.13. O'Neill, I.D., t(11;19) translocation and CRTC1-MAML2 fusion oncogene in mucoepidermoid carcinoma. Oral Oncol, 2009. 45(1): p. 2-9.14. Bartel, S., et al., Pulmonary microRNA profiles identify involvement of Creb1 and Sec14l3 in bronchial epithelial changes in allergic asthma. Sci Rep, 2017. 7: p. 46026.