在第3次和第4次KA誘導(dǎo)后的前兩天的監(jiān)控錄像中我們觀察到，食蟹獼猴表現(xiàn)出由左側(cè)前肢開始的自發(fā)性痙攣，接著是直立和平衡喪失，每天跌倒約5~10次。但是在慢性期沒有觀察到這樣的現(xiàn)象。

在食蟹獼猴最后一次接受KA注射后的三個月里，連續(xù)4周以每周一次的頻率記錄持續(xù)60分鐘的EEG腦電。如圖所示，在的腦電結(jié)果中我們觀察到了大量位于顳葉棘波（15~90次/30 min）。95%的棘波出現(xiàn)在右側(cè)顳葉，在左側(cè)顳葉也檢測到同步的棘波。

EEG腦電顯示，每次發(fā)作會有持續(xù)10~15秒的高頻同步放電活動，猴子也表現(xiàn)出凝視和刻板樣行為。隨后，猴子出現(xiàn)緩慢轉(zhuǎn)頭和舔唇動作。在慢性癲癇階段的EEG腦電圖記錄中，我們沒有監(jiān)測到全身性陣攣性發(fā)作或運動癥狀。這種表現(xiàn)與顳葉癲癇的臨床表現(xiàn)一致，因為在顳葉癲癇患者中也很少出現(xiàn)全身性陣攣性發(fā)作。

為了評估顳葉癲癇模型的建模效果，我們對處于慢性癲癇期的猴子進(jìn)行了長期連續(xù)的視頻記錄。與預(yù)期一致，在注射KA后的 3~6個月，在任何猴子身上都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的驚厥發(fā)作。這與之前的報道一致，該研究發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性癲癇的慢性階段，接受顳葉癲癇造模處理的獼猴沒有表現(xiàn)出明顯的驚厥發(fā)作。

創(chuàng)新性

以往的非人靈長類顳葉癲癇模型均為恒河猴模型，食蟹猴相比于恒河猴具有體積小、便于實驗操作的優(yōu)點。

動物模型的制備和應(yīng)用實驗在具備相應(yīng)資質(zhì)的實驗室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1. KA注射后誘導(dǎo)急性癲癇發(fā)作

KA注射后約30 min，食蟹猴開始從麻醉中蘇醒，開始出現(xiàn)分泌唾液，呼吸加快，單個肢體不自主抽搐進(jìn)而演變成雙側(cè)肢體不自主抽搐，全身性強(qiáng)直-陣攣性抽搐。發(fā)作約60 min后在沒有抗癲癇治療的情況下恢復(fù)正常。

2. 病理驗證

如果對急性癲癇發(fā)作后死亡的食蟹猴進(jìn)行大腦病理解剖，經(jīng)過蘇木素染色后的病理結(jié)果顯示，注射位點位于海馬齒狀回區(qū)域，海馬CA3區(qū)域錐體神經(jīng)元發(fā)生神經(jīng)元核固縮，存在大量死亡的現(xiàn)象。

3. KA注射前后的腦電記錄驗證（圖示見“有助于動物模型鑒定和評價的其它材料”）

注射前腦電以慢波（θ波）為主，無明顯尖波和棘波（圖 2A）。

急性期癲癇樣尖波首先在注射側(cè)顳葉出現(xiàn)，隨后擴(kuò)散至前額葉（圖 2B）。腦電記錄中可觀察到5-9Hz高波幅節(jié)律性癲癇樣尖波。約10min后食蟹猴進(jìn)入狀態(tài)性癲癇發(fā)作，腦電中觀察到雙側(cè)對稱爆發(fā)性10-14 Hz節(jié)律性尖波（圖 2D）以及出現(xiàn)肌電干擾（圖 2C），食蟹猴表現(xiàn)出肢體顫動。狀態(tài)性癲癇發(fā)作過程維持約60 min。注射生理鹽水組食蟹猴在注射前后腦電信號沒有顯著變化。

4. KA注射3個月后的腦電驗證（圖示見“有助于動物模型鑒定和評價的其它材料”）

該模型在KA注射后具有自發(fā)性的癲癇異常放電。在KA注射后3個月，麻醉后通過腦電記錄，可檢測到整個大腦的尖波異常放電。證實模型建立成果，具有癲癇發(fā)作慢性期的自發(fā)性異常尖波放電。如果沒有檢測到慢性期的異常腦電，說明建模不成功，原因可能是KA誘導(dǎo)的急性癲癇發(fā)作程度不夠，導(dǎo)致初始的海馬損傷不夠強(qiáng)烈。

5. 公開發(fā)表的論文依據(jù)

本模型建立的相關(guān)工作發(fā)表于國際研究期刊：Chen T, et al. A cynomolgus monkey model of temporal lobe epilepsy.Brain Research Bulletin, 2019, 144(187-193).

實驗材料

8-10歲食蟹猴雌性四只，雄性2只，4ug/ul/kg KA工作液，3%的戊巴比妥鈉溶液，3% H2O2，75%醫(yī)用酒精，醫(yī)用消毒脫脂棉，醫(yī)用消毒棉簽，手術(shù)器械，手術(shù)縫合線，非人靈長類動物立體定位注射儀，醫(yī)用小動物打孔器，電動理發(fā)機(jī)，一次性醫(yī)用注射器，微量注射玻璃針，非人靈長類動物固定架。

實驗環(huán)境

屏障環(huán)境，非人靈長類實驗動物專用手術(shù)間。

實驗方法

1. 食蟹猴麻醉，一次性醫(yī)用注射器靜脈注射3%的戊巴比妥鈉溶液（1 kg/ml），食蟹猴深度麻醉后（顳子輕輕夾腳趾無反應(yīng)，呼吸均勻）轉(zhuǎn)移到非人靈長類動物立體定位注射儀上，固定頭部。

2. 食蟹猴轉(zhuǎn)移到非人靈長類實驗動物專用手術(shù)間，食蟹猴和手術(shù)人員全身消毒。

3. 用電動理發(fā)機(jī)剪剪去食蟹猴頭部毛發(fā)，暴露頭皮，75%醫(yī)用酒精和碘伏依次消毒皮膚3遍，用消毒后的手術(shù)刀切開右側(cè)頂骨皮膚，位于海馬正上方，切口長度約10 mm，暴露顱骨。

4. 用醫(yī)用棉簽蘸取3% H2O2，輕輕擦拭顱骨表面組織；醫(yī)用棉簽蘸取75%醫(yī)用酒精擦去殘留的H2O2，醫(yī)用棉簽擦凈顱骨表面。

5. 牙科打孔器打出直徑約1 mm的孔洞，到硬腦膜止。

6. 用立體定位方法定向單側(cè)海馬CA區(qū)注射海人酸（kainic acid，KA）。注射位點為食蟹獼猴右側(cè)海馬，坐標(biāo)：以右側(cè)耳蝸與中縫連線的交點為原點，向前10 mm，再向右10 mm，深度為硬腦膜下35 mm。單次KA注射量4μg/μl/kg，注射后停針10分鐘。

7. 注射完畢后，收回注射針，縫合線縫合食蟹猴頭頂傷口，消毒傷口附近皮膚。將注射結(jié)束后的食蟹猴轉(zhuǎn)移到溫暖安靜的檢測室中，使用非人靈長類動物固定架固定食蟹猴的四肢和頭部，卡槽留有縫隙食蟹獼猴頭部可以輕微轉(zhuǎn)動，接下來準(zhǔn)備腦電記錄。

8. 食蟹猴腦電記錄選用Open-BCI 無線腦電記錄模塊。腦電記錄前使用75%酒精擦拭食蟹獼猴頭部皮膚，以去除毛發(fā)碎屑以及油脂。采用頭皮電極和對食蟹猴顳葉進(jìn)行腦電記錄。頭皮電極使用方法：將涂抹導(dǎo)電膏的杯狀電極別貼附于雙側(cè)額葉（P3/P4）、雙側(cè)顳葉（F3/F4），以枕葉中縫（Cz）作為參考，右前肢食指接地。為了排除心電干擾，于心前區(qū)放置一個盤狀電極記錄心電圖。為了排除心電干擾，心前區(qū)放置一個盤狀電極記錄心電圖。EEG采集過程中，參數(shù)分別設(shè)置為靈敏度30 μV/mm，時間常數(shù)0.3 S，濾波范圍0.5~50 Hz，采樣頻率250 Hz。

9. 腦電記錄結(jié)束后將食蟹猴放在舒適恒溫的環(huán)境中使其自然蘇醒，在此過程中密切觀察食蟹猴的呼吸和體溫，如食蟹猴有表現(xiàn)出不適應(yīng)立即聯(lián)系獸醫(yī)，食蟹猴蘇醒后放回原來的籠位，及時補(bǔ)充食物和飲水。

10. 本研究中，每只食蟹獼猴接受3~4次KA誘導(dǎo)，每周一次。

研究目的及意義

癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，據(jù)估計，全世界范圍內(nèi)約有5000萬癲癇患者，每年的癲癇發(fā)生率約為240萬。我國目前約有900萬的癲癇患者，約占全世界癲癇患者總數(shù)的1/5.

部分性癲癇患者約占癲癇患者總數(shù)的60%，部分性癲癇是指癲癇的病灶位于大腦半球中的一個或者位于一側(cè)大腦半球的局部區(qū)域內(nèi)。顳葉癲癇是部分性癲癇的常見類型。顳葉癲癇患者中約有1/3的患者對于常見的抗癲癇藥物治療無效，這使得顳葉癲癇成了成人最難治療的癲癇類型。對于這些患者，手術(shù)切除治療是唯一的治療選擇。顳葉癲癇手術(shù)治療前需要準(zhǔn)確定位致癲組織，手術(shù)切除時更需要完整切除致癲灶。但是由于致癲組織切除不足，仍有30%左右患者出現(xiàn)癲癇復(fù)發(fā)。對于無法準(zhǔn)確定位致癲組織的癲癇患者來說，手術(shù)切除并不適合他們。

非人靈長類（non-human primates, NHPs）是指除了人類以外，其他所有靈長類動物的總稱，包括11科51屬，近400種動物。NHPs可分為新世界猴和舊世界猴。新世界猴包括狨猴屬（Marmosets）的普通狨猴（common Marmosets）等，具有對結(jié)核病存在抵抗力，不易攜帶B病毒，無頰囊等特點。舊世界猴包括彌猴屬（macaque）的食蟹獼猴（Macaca fascicularis）和恒河猴（rhesusmacaque）等，其特點是對結(jié)核桿菌敏感，易攜帶B病毒，存在大頰囊。

嚙齒類實驗動物在遺傳上只有84%基因序列與人類相同，其生理功能和解剖結(jié)構(gòu)與人類存在巨大差異，不能嚴(yán)格地預(yù)測藥物的療效或?qū)θ祟惖臐撛诙拘?。而NHPs有超過98%基因序列與人類相同，其脾，外周血單核細(xì)胞，肝的基因組轉(zhuǎn)錄水平與人類的相似度分別達(dá)到了91.41%，84.36%和74.29%。這種遺傳水平和生理代謝上的高度接近使NHPs成為人類疾病研究的理想模型，特別在重性腦疾病，心血管疾病和疫苗研發(fā)等重點研究領(lǐng)域 。

海人酸（kainic acid, KA）是L-谷氨酸的環(huán)狀類似物以及離子型KA受體激動劑，最早從海藻中提取，當(dāng)作殺蟲劑使用。KA處理神經(jīng)元可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的去極化作用最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，這也是顳葉癲癇主要的病理表現(xiàn)。KA處理的嚙齒類動物最開始具有急性期癲癇發(fā)作，隨后進(jìn)入4-5周的潛伏期，最終進(jìn)入難治性的自發(fā)性癲癇發(fā)作階段。KA處理的嚙齒類動物會有海馬硬化相關(guān)的病理表現(xiàn)，包括海馬神經(jīng)元丟失，顆粒細(xì)胞散布，苔狀纖維發(fā)芽等，這與顳葉癲癇患者的病理表現(xiàn)接近。

使用顳葉癲癇非人靈長類海人酸模型可以更好地模擬顳葉癲癇患者地臨床表現(xiàn)，為顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制的研究以及抗顳葉癲癇藥物的研發(fā)提供幫助。

國內(nèi)外研究進(jìn)展

Chen等人通過定向海馬注射KA方法成功建立顳葉癲癇恒河猴模型，研究觀察到了急性期的癲癇樣放電，包括肢體抽搐，流涎等典型癲癇癥狀，但是在慢性期監(jiān)測中沒有觀察到亞臨床癲癇發(fā)作。Perez等人報道通過全身給藥的方式注射匹羅卡品誘導(dǎo)的mTLE狨猴模型，在此模型的慢性期腦電中監(jiān)測中不僅檢測到了亞臨床癲癇樣放電還觀察到了自發(fā)性癲癇發(fā)作，但是沒有觀察到癲癇間期放電的特征圖。相比于恒河猴，食蟹猴體積小，性格溫順，容易獲得，因此食蟹猴在人類疾病模型研究操作起來更加方便。