該模型在研究輻射損傷及機體老齡化相關的損傷中具有廣泛的應用價值。國內已有相關單位咨詢引用。

在誘導模型過程中，照射設備具有自身屏蔽裝置，使用安全，不會對人體及環(huán)境造成任何影響。

1. 受照小鼠受照后外周血計數(shù)檢測

C57小鼠接受4Gy和6GyTBI，6m后全自動血液分析儀測定外周血，發(fā)現(xiàn)白細胞數(shù)（WBC）、紅細胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）、淋巴細胞百分比（LY%）下降，與假照射組小鼠有明顯差異。中性粒細胞百分比（NE%）（圖1）。

注：A.白細胞計數(shù)B.紅細胞計數(shù)C.血紅蛋白濃度D.血小板計數(shù)E.中性粒細胞百分比F.淋巴細胞百分比。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

圖1. 受照組小鼠與對照組小鼠外血計數(shù)比較

2.免疫臟器系數(shù)

與對照組小鼠相比，4Gy組和6Gy組小鼠胸腺系數(shù)降低，。其中6Gy組與對照組差異有顯著性（P＜0.05），脾臟系數(shù)略有增加，差異無顯著性，結果見圖2。

注：A.胸腺系數(shù)B.脾臟系數(shù)。*：P＜0.05。

圖2. 受照組小鼠與對照組小鼠臟器系數(shù)比較

3.外周血免疫分型

相對于對照組，4Gy組和6Gy組CD4+均有上升，從分別從12.49±1.16%上升到14.6±0.51%和16.48±2%，均具有顯著性差異（P＜0.05）。CD8a+細胞三個組別之間未見明顯變化。CD4/CD8比值分別為對照組：1.16±0.10，4Gy照射組1.28±0.17，6Gy照射組1.46±0.26，6Gy組CD4/CD8比值與對照組比較有明顯上升（P＜0.05）。B220+細胞從對照組62.89±2.33%降低到4Gy照射組55.63±3.61%和6Gy照射組54.2±3.54%，差異均具有極顯著性（P＜0.001）。NK1.1+細胞與B220+細胞變化趨勢一樣，分別從8.44±0.7%降低到6.81±1.58%和6.6±0.65%。上述三組4Gy和6Gy之間差異均無顯著性區(qū)別。單核細胞三個組別之間未見到明顯差異。結果見圖3。

注：A. CD4+ B. CD8+ C. B220+ D. NK1.1+ E. CD11b&F4/80+F. CD4+/CD8+。*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

圖3. 老年小鼠與年輕小鼠外周血免疫細胞分型比較

4.脾臟免疫細胞分型

相較于對照組，照射組CD3+細胞有上升的趨勢，但無顯著性差異。B220細胞，照射組均有明顯下降，4Gy組和6Gy組相較于對照組有極顯著差異（P＜0.01），兩組之間未見明顯差異。見圖4。

注：A. CD3+ B. B220+。**：P＜0.01。

圖4.受照組小鼠與對照組小鼠脾臟免疫細胞分型比較

5.脾臟T細胞P16mRNA表達量檢測

結果顯示，與對照組相比，6Gy組有個別數(shù)據p16 mRNA明顯升高，采用卡方檢驗，未見顯著性差異。結果見圖5。

圖5.受照組小鼠與對照組小鼠脾臟T細胞的P16 mRNA表達比較

（一）實驗材料

1.實驗動物

10~12周齡的SPF級雄性健康C57BL/6J小鼠，體重22~24g，共24只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2014-0004]。小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所動物房屏障環(huán)境[SYXK(津)2014－0002]。本實驗經過中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所IACUC的批準，批準號為1402。并根據3R原則對實驗動物的使用和飼養(yǎng)給予人道關懷。

2.試劑與儀器

熒光標記抗體NK1.1-FITC購于Biolegend公司；CD11b-APC，購于Invitrogen公司；B220-percp、F4/80-PE、CD4-PE-cy7、CD8a-APC-cy7購于BD公司；B220-percp-cy5.5、CD3-APC購于biolegend公司。EDTA-K3購于sigma公司。紅細胞裂解液購于Invitrogen公司。大鼠脾臟單個核細胞分離液試劑盒購于索萊寶公司。EasySep?Mouse T Cell Isolation Kit購于STEMCELL Technologies公司。全自動血液分析儀MEK-7222K（日本光電）；BD流式分析儀（BDFACSAria II cell sorter，BD Bioscience ）。銫源伽馬射線輻照儀（Gammacell-40，加拿大原子能有限公司）。

（二）實驗方法

1.小鼠分組和照射

小鼠均分為三組：對照組（假照射組），4Gy IR組（4Gy組），6Gy IR組（6Gy組）,照射劑量率為1Gy/min。小鼠于SPF級動物房中飼養(yǎng)，照射后每天觀察記錄體重變化。

2 小鼠外周血常規(guī)檢測

小鼠TBI后6m小鼠眼眶靜脈叢取血，抗凝管收集外周血，全自動血液分析儀測定外周血中白細胞數(shù)（WBC）、紅細胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指標。

3 小鼠胸腺、脾臟指數(shù)測定

小鼠TBI 后6m稱重安樂死，取胸腺、脾臟并稱重，計算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器(mg)/體重(g)。

4 外周血免疫細胞和脾臟淋巴細胞分型檢測

小鼠TBI后6m，將分離的小鼠脾臟研磨制備脾細胞懸液。分別取外周血和細胞懸液50μL，各加入1mL 1×紅細胞裂解液，室溫條件下裂解8min（期間混勻兩次），1500r/min離心5min，4℃。棄上清，保持每個樣本100μL體系，加入對應的混合抗體，冰上避光孵育30min。2mL PBS洗一遍，離心條件不變。加入300μLPBS過濾到流式管中，上機檢測。

5 脾臟T細胞分離及P16mRNA表達量檢測

小鼠TBI后6 m，按索萊寶ficoll試劑盒和STEMCELLTechnologies的T細胞陰選試劑盒說明書方法進行分離。將收集的細胞重懸計數(shù)，按每1~5×106個細胞加入1mL trizol保存，送至上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司檢測P16mRNA表達量。

6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPadPrism 6軟件(SanDiego，CA，USA)處理數(shù)據、作圖，計量資料數(shù)據用均數(shù)±標準差（x?± s）表示，組間差異采用ANOVA檢驗和卡方檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

一、疾病概述

隨著科學技術的進步，核電設施使用增多，人類太空活動能力提升使輻射暴露的可能性不斷增加。另外臨床接受放射性治療癌癥患者也在不斷上升。造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)對電離輻射（Ionizing Radiation，IR）具有高度的敏感性。受照后不僅會引起急性骨髓抑制，對遠期造血免疫功能也會有影響。受到亞致死劑量照射后會出現(xiàn)造血免疫系統(tǒng)急性損傷性變化。隨著時間延長機體各項免疫指標逐步恢復，但也會出現(xiàn)一些持久性改變，從而影響機體的健康狀態(tài)。

二、模型背景

1、實驗動物背景信息

C57BL/6J小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

2、研究背景

該動物模型的研究目的及意義；該動物模型的國內外研究進展并附參考文獻。隨著核電站的建立，人類太空活動的增加，臨床上放射診療設備的廣泛應用，以及核武器恐怖威脅等因素的存在，人類的輻射暴露性可能性日益增加。2001年美國國家輻射保護委員會指出，當出現(xiàn)核事故，多數(shù)人可能受到1．10Gy齊J量的電離輻射(Ionizingradiation，IR)照射。輻射引起的重要臟器損傷會導致受照射人員死亡。其中，骨髓抑制(bonemarrow suppression)是一個主要的致死原因。骨髓抑制分為急性骨髓抑制(acutebone marrow suppression)和長期骨髓抑制(10ng—termbone marrow suppression)，急性骨髓抑制主要是電離輻射引起的造血祖細胞(hernatopoieticprogenitor cells，HPCs)和少量的造血干細胞(hematopoieticstem cells，HSCs)凋亡，以及誘導造血祖細胞增殖障礙。臨床上，可以給予造血細胞因子(hemopoieticfactors，HGF)緩解癥狀。長期骨髓抑制是輻射遠期損傷的主要表現(xiàn)，也是臨床進行腫瘤放療、化療時最常見的毒副作用之一，直接影響到治療效果及患者的生存質量。長期骨髓抑制不像急性期骨髓抑制，往往患者外周血象并無明顯異常，尤其給予細胞因子治療后，外周血白細胞有了較好的恢復；長期骨髓抑制具有遲發(fā)性，在臨床上容易被忽視，目前尚無有效治療手段。

從細胞層面，電離輻射可以誘導造血干細胞、祖細胞細胞的凋亡，損傷造血千細胞、祖細胞的增殖能力，誘導造血干細胞進入細胞周期，無法維持在靜止期，并且會損傷造血干細胞微環(huán)境的功能。

從分子層面，輻射誘導的DNA損傷，氧化應激和端?？s短均是造血干細胞衰老的誘因。其中IR誘導的氧化應激或活性氧水平升高具有重要作用。電離輻射誘發(fā)細胞內活性氧(reactiveoxygen species，ROS)的表達。ROS主要包括超氧陰離子(02-)，羥自由基(HO-)，過氧化氫(H2O2)，單線態(tài)氧(1O2)，次氯酸(HOCI)等組成。ROS正常條件下可以調節(jié)多種生理活動，病理條件下，產生過量的ROS則會引起DNA損傷，基因組不穩(wěn)定性增加，隨著年齡的增加，ROS損傷產物的累積會引起細胞衰老以及衰老相關的疾病。細胞ROS主要由線粒體呼吸產生，近來研究結果顯示，由于造血干細胞大多數(shù)處于靜止期，線粒體含量與骨髓中其他細胞相比線粒體含量非常低，在造血干細胞中，主要是由NADPH氧化酶家族中(NADPHoxidases，NOXs)的NOX4產生的ROS來調控造血干細胞的功能。HSCs比分化的細胞對氧化應激更敏感。

但是現(xiàn)有研究階段缺乏輻射引起長期的造血系統(tǒng)損傷數(shù)據。對長期造血系統(tǒng)損傷缺乏深入研究。有待進一步研究長期造血系統(tǒng)損傷對整個機體及造血系統(tǒng)微環(huán)境的影響。

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