1.該模型制備比較成熟，國(guó)內(nèi)外都有此模型，構(gòu)建和評(píng)價(jià)指標(biāo)一致，所以該模型應(yīng)用廣泛，具有統(tǒng)一的操作規(guī)程。

2. 該模型制備的關(guān)鍵：1）小鼠必須是重度免疫缺陷的，而且飼養(yǎng)環(huán)境必須潔凈；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系統(tǒng)，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的臨床癥狀，所以具有很高的比較醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

所有感染動(dòng)物必須在ABSL-3室中進(jìn)行。

1、 SIVmac239直腸感染恒河猴血漿病毒載量結(jié)果

SIVmac239感染10次之后，恒河猴G0101R-G0108R均已被感染，血漿病毒RNA載量和載量峰值的時(shí)間點(diǎn)各不相同。其中，G0103R，G0107R和G0108R這三只猴在感染后病毒載量直接到達(dá)高峰，并出現(xiàn)典型的疾病進(jìn)程，其中G0103R第14天時(shí)達(dá)到高峰，峰值約106copies/mL，G0107R和G0108R在感染后第28天達(dá)到峰值，這三只猴的病毒載量出現(xiàn)相對(duì)較早；G0102R，G0104R和G0105R在感染后2-3周病毒載量呈現(xiàn)低拷貝復(fù)制狀態(tài)，波動(dòng)在102-103 copies/mL之間，而到40天時(shí)，病毒載量才達(dá)到高峰，上升到106copies/mL；而G0101R和G0106R的病毒載量一直處于臨界值，時(shí)有時(shí)無(wú)，從未達(dá)到病毒載量的高峰。根據(jù)病毒載量的情況及變化規(guī)律（圖1）。8只恒河猴可分成三組類(lèi)型：G0101R和G0106R劃分為第一組（典型疾病進(jìn)展型），將G0102R，G0104R和G0105R劃分為第二組（延遲進(jìn)展型），將G0103R，G0107R和G0108R劃分為第三組（隱匿型）。

圖1 SIVmac239小劑量多次直腸途徑感染中國(guó)恒河猴血漿病毒載量結(jié)果

Fig.1 The viremia (viral RNA copies/mlplasma) in Chinese-original rhesus macaques infected intrarectally withrepeated low dose of SIVmac239

SIVmac239直腸感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值結(jié)果

外周血中CD4+/CD8+的比例變化除G0103R在第88天時(shí)出現(xiàn)明顯倒置外，其余恒河猴外周血中CD4+/CD8+的比例在整個(gè)感染過(guò)程中均未出現(xiàn)倒置現(xiàn)象。G0101R和G0106R猴CD4+/CD8+的比例變化在感染后46天時(shí)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，但到感染后第88天時(shí)，其比例又恢復(fù)到接近感染前的水平，波動(dòng)在1.4-2.4之間。G0102R，G0104R和G0105R猴CD4+/CD8+的比例在感染后第7天時(shí)有所增加，隨后一直平穩(wěn)維持在1.5-2.5之間，到第88天時(shí)，其比例有所下降，并出現(xiàn)CD4+/CD8+比例倒置現(xiàn)象，其比例約為0.9左右。G0103R，G0107R和G0108R猴以G0103R變化最明顯，其比例呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，到第88天時(shí)，CD4+/CD8+比例下降到0.39，其余兩只猴未出現(xiàn)CD4+/CD8+比例倒置現(xiàn)象，波動(dòng)在1.1-1.3之間（圖2）。

圖2 SIVmac239小劑量多次直腸途徑感染中國(guó)恒河猴外周血CD4+/CD8+比值

Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytes in Chinese-original rhesus macaques infectedintrarectally with repeated low dose of SIVmac239

1、 SIVmac239直腸感染恒河猴CD4+和CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)結(jié)果

感染猴外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)在SIVmac239感染前后變化幅度不大，只是變化趨勢(shì)有所不同，G0101R和G0106R猴CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)在感染第88天時(shí)略高于感染前的水平，其中以G0101R增加最顯著，由感染前的1.5×103個(gè)/uL增加到感染后第88天時(shí)的2.1×103個(gè)/uL。G0103R，G0107R和G0108R猴感染前的CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)低于其他5只，波動(dòng)在600-800個(gè)/uL之間，到感染后第14天時(shí)，有所下降，隨后有所恢復(fù)，到第88天時(shí)，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)略低于感染前的水平。G0102R，G0104R和G0105R猴的CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)也同樣在感染后第14天出現(xiàn)下降，21天時(shí)又有所增高，但與感染前相比，到感染后第88天時(shí)，這三只猴的CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)均略低于感染前的水平（圖3A）。

SIVmac239感染后，G0101R和G0106R猴CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的波動(dòng)較為平穩(wěn)，未出現(xiàn)顯著的降低或者升高的現(xiàn)象。G0103R，G0107R和G0108R猴CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的變化也相對(duì)穩(wěn)定，在感染前其絕對(duì)數(shù)的水平也相對(duì)較低，但是G0103R的絕對(duì)數(shù)在第14天下降之后明顯增高，可達(dá)474個(gè)/uL，隨后一直維持在此水平上波動(dòng)。G0102R，G0104R和G0105R猴的CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)在感染后第14天時(shí)下降最為顯著，最低可達(dá)340個(gè)/uL，隨后有所恢復(fù)，到第88天時(shí)，其絕對(duì)數(shù)變化接近感染前的水平（圖3B）。

圖3SIVmac239小劑量多次直腸途徑感染恒河猴外周血CD4+和CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)變化

Fig.3 The CD4+ cell counts and CD8+ cell counts (per l blood) inChinese-original rhesus macaques infecte intrarectally with repeated low doseof SIVmac239

1、 實(shí)驗(yàn)用病毒：感染毒株為SIVmac239中國(guó)恒河猴細(xì)胞適應(yīng)株，使用中國(guó)恒河猴PBMCs擴(kuò)增制備，CEMx174細(xì)胞滴定TCID50為3×105/mL。

2、 感染動(dòng)物：選用體重4-6kg的SPF恒河猴。實(shí)驗(yàn)前體檢無(wú)異常，必須排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相關(guān)的4種基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）篩查結(jié)果為陰性。所有感染動(dòng)物必須在ABSL-3室中進(jìn)行。

3、 感染方法：將麻醉好的實(shí)驗(yàn)猴放在操作臺(tái)上，動(dòng)物采取俯臥位以保證直腸粘膜充分暴露，緩慢將SIVmac239中國(guó)恒河猴細(xì)胞適應(yīng)株的稀釋液注入肛竇處，實(shí)驗(yàn)猴保持此姿勢(shì)30min。

4、 SIVmac239直腸感染猴樣品采集和指標(biāo)測(cè)定：用DMEM培養(yǎng)基稀釋成100TCID50/3mL和1000TCID50/3mL兩種濃度，采用小劑量多次直腸暴露的方式感染，3mL/只。共接種10次，2次/周。在每次感染前及10次感染結(jié)束后定期采EDTA抗凝血3ml，分別測(cè)定血常規(guī)、血漿病毒載量、CD4+/CD8+、CD4+和CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

5、 SIVmac239直腸感染猴血漿病毒載量的測(cè)定：提取EDTA抗凝血漿中病毒RNA，使用SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測(cè)定血漿病毒載量。

6、 SIVmac239直腸感染猴外周血CD4+/CD8+比值及絕對(duì)數(shù)測(cè)定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗體標(biāo)記EDTA抗凝全血淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD4+/CD8+比值，并根據(jù)血常規(guī)結(jié)果，計(jì)算出CD4+和CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病，是20世紀(jì)危害人類(lèi)健康和生命最嚴(yán)重的病毒性疾病之一。自美國(guó)CDC報(bào)道首例艾滋病后，到20世紀(jì)80年代中期艾滋病發(fā)展成為一個(gè)性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690萬(wàn)人，2014年新增感染者200萬(wàn)，2014年因艾滋病死亡120萬(wàn)人。艾滋病在1985年傳入我國(guó)，截至2015年5月31日，歷年累計(jì)報(bào)告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成為關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題，艾滋病的預(yù)防與治療也成為當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)之一。

二、艾滋病動(dòng)物模型簡(jiǎn)介

艾滋病發(fā)病機(jī)制研、藥物和疫苗的保護(hù)性研究及評(píng)價(jià)等方面在很大程度上依賴(lài)?yán)硐氲膭?dòng)物模型。人們發(fā)現(xiàn)HIV以后，用HIV感染過(guò)多種動(dòng)物，但由于種種原因，結(jié)果并不理想。研究發(fā)現(xiàn)猴免疫缺陷病毒(SIV)感染實(shí)驗(yàn)用猴的模型效果比較理想，表現(xiàn)為和AIDS的臨床表征，發(fā)病過(guò)程、免疫缺陷特征等非常相似，加之HIV和SIV有一定的基因同源性，人和猴的生物學(xué)特性也較其他動(dòng)物接近，因而，SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被廣泛接受和應(yīng)用。

SIV是猴獲得性免疫缺陷綜合征（SimianImmune Deficiency Syndrome，SAIDS）的主要致病病毒，為典型的C型病毒粒子，基因組長(zhǎng)度大約為9.2kb，基因組成同HIV-1和HIV-2基本相同，其完整的原病毒基因含有二個(gè)LTR以及同HIV類(lèi)似的基因：gag、pol、vif、tat、rev、env和nef。所有基因在SIV的排列順序同HIV完全一樣。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SIV的研究多集中在非克隆株SIVmac251和克隆株SIVmac239上，因?yàn)檫@兩個(gè)病毒株能在多種獼猴屬動(dòng)物身上引發(fā)致死性免疫缺陷綜合征，同時(shí)伴有CD4+淋巴細(xì)胞下降，繼發(fā)機(jī)會(huì)性感染病毒性腦膜腦病。這些都與人類(lèi)AIDS類(lèi)似。

艾滋病的三種傳播途徑分別是經(jīng)血液、性和母嬰傳播，性傳播包括同性傳播和異性傳播兩種方式。艾滋病動(dòng)物模型的制備首先要考慮其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，最好的動(dòng)物模型可以最大限度的模擬人類(lèi)疾病，包括使用與自然感染相同或接近的方式建立模型。為模擬同性間性傳播的感染方式，通過(guò)直腸粘膜上皮途徑感染，病毒直接感染M細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。直腸的生理構(gòu)造及上皮細(xì)胞厚度非常薄等特點(diǎn)，都使直腸感染較陰道感染容易發(fā)生。將病毒緩慢注入猴直腸內(nèi)，可建立同性性傳播動(dòng)物模型。